聚乙二醇200 基硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白的相互作用
2013-10-17 14:48:07 点击：
2. 1 荧光光谱
由图1 可知,聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KHL 的荧光发生猝灭,且随药物浓度的增加KHL 荧光强度逐步降低。
这表明两者之间存在着相互作用,且随聚乙二醇200 基硝苯柳胺浓度的增加两者的结合趋向饱和。在激发波长为280nm 时,色氨酸最大荧光发射峰在340 nm 左右[526 ] ,复合体系在340 nm 处荧光强度显著降低,这表明药物与KL H 结合时位于或接近于色氨酸残基。
2. 2 猝灭机理和猝灭速率常数
假设此荧光猝灭是动态猝灭,则荧光强度可用Stern2Volmer 方程F0 / F = 1 + Kqτ0 [Q ] = 1 + KSV [Q ] 处理[7 ] ,以F0 / F 对[ Q ] 作Stern2Volmer 图, 作Stern2Volmer 曲线拟合,得出298 K、310 K、320 K时双分子猝灭过程速率常数分别为3. 73 ×1012 、3. 12 ×1012 、2. 88 ×1012 L•mol- 1 •s - 1 ,均大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数(2. 0 ×1010L•mol- 1 •s - 1 ) ,由此说明荧光猝灭不是动态双分子猝灭过程,而是由于聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H结合形成了复合物引起的静态猝灭。
2. 3 结合常数K
在静态猝灭中,结合常数K 与荧光强度、猝灭剂浓度之间的关系可以用Lineweaver2Burk 双倒数函数表示[8 ] : ( F0 - F) - 1 = F - 10 + K- 1 F - 10 [Q ]- 1 ,以( F0 - F) - 1对[Q ] - 1作双倒数图,求得聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 在298 K、310 K、320 K的结合常数分别为3. 78 ×104 、3. 12 ×104 、2. 51 ×104 L•mol- 1 , K值均为104 数量级,表明它们之间的结合力较强。此外,结合常数随温度升高而减小,进一步说明药物对KL H 的内源荧光猝灭过程主要为静态猝灭。
2. 4 热力学参数和作用力类型
根据反应前后的焓变△H 和熵变△S 的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。
根据聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 的结合常数K ,并结合热力学方程求出不同温度下反应的△G、△H 和△S ,把得到的数据列于表1 中。从表1 中的数据可以看出: △H < 0 , △S > 0 ,所以聚乙二醇200基硝苯柳胺与KL H 之间的作用力主要为静电引力[9 ] 。但在许多情况下,有机小分子与蛋白的反应是多种力协同作用的结果,聚乙二醇200 基硝苯柳胺分子母核有较强的疏水作用,因此疏水作用力也可能参与了药物与KL H 间的作用过程。从热力学角度来看,在一定温度和压力下,药物与KL H 的结合反应能否自发进行取决于△G, △G< 0 时则有利于反应的自发进行。从表1 可以看出△G< 0 ,所以药物与KL H 之间的结合是自发进行的。
2. 5 结合距离的计算
根据FÊrster的非辐射能量转移理论[10 ] ,在25 ℃时做出聚乙二醇200 基硝苯柳胺的紫外2可见吸收光谱和KL H 的荧光光谱,两光谱有一定程度的重叠(图2) 。求得光谱的重叠积分J = 1. 36 ×10 - 14 cm3 •L•mol- 1 ,转移效率为50 %时的临界距离R0 = 3. 80 nm 和转移效率E = 0. 076 ,进而求出给体2受体间距离r = 5. 76 nm , r < 7 nm ,从而说明聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 结合时是通过非辐射能量转移机制导致蛋白质的荧光发生猝灭的[11 ] 。
2. 6 聚乙二醇200 基硝苯柳胺对KLH构象的影响
在△λ= 15 nm 和△λ= 60 nm 时,分别向KL H 溶液中逐渐增加聚乙二醇200 基硝苯柳胺的浓度(图3) 。随着药物的浓度逐渐增加,色氨酸残基的最大发射波长没有明显改变,而酪氨酸残基的最大发射波长缓慢地减小,说明聚乙二醇200基硝苯柳胺的加入对使酪氨酸残基周围的疏水性增加[12213 ] 。
这说明聚乙二醇200 基硝苯柳胺在钉螺体内能够被血蓝蛋白存储和转运时对蛋白构象有一定影响。
通过圆二色(CD) 谱可以灵敏地检测一些反应引起的蛋白分子的二级结构变化[14 ] 。如图4 所示, KL H 在209 nm 和221 nm 左右表现出两个负的吸收峰,主要为α2螺旋结构的蛋白质[15 ] 。随着聚乙二醇200 基硝苯柳胺浓度的增加,KL H 在209 nm 和221 nm 左右处两个负吸收峰的强度减小,但形状和肩峰的位置未发生明显改变,表明聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KL H 中的α2螺旋的含量降低。通过CD 谱仪二级结构分析软件计算,α2螺旋的含量由42. 1 %下降到34.7 %,β2折叠含量由10. 2 %变为9. 1 %,而β2转角的含量由22. 8 %变为26. 9 %。以上结果表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺诱导KL H 发生了二级结构改变,这是导致KL H 内源性荧光猝灭的原因。
参考文献:
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